Геномные векторы

Рис.15. Осуществление делеции участка клонированного фрагмента. Вверху: схема клонированного фрагмента гена jmj (длина фрагмента 110kb). Белые прямоугольники, экзоны. Внизу: делеция участка длиной 24 kb путём гомологичной рекомбинации по двум LPS (внутренний участок вставки и участок последовательности pBR322).

Полученные результаты показывают, что в геномном векторе можно клонировать ДНК практически любой типа. Приготовление двух фланкирующих сегментов перед созданием BGM неизбежно, однако позволяет осуществлять позиционное клонирование молекул ДНК размерами, превышающими лимит технологии ПЦР. Клонирование с помощью геномного вектора имеет несколько преимуществ по сравнению с клонированием с помощью плазмидных векторов. Процесс клонирования в плазмидных векторах сильно зависит от рестрицирующих эндонуклеаз и наличия определённых сайтов рестрикции. Кроме того, при использовании таких векторов невозможны дальнейшие манипуляция с клонированной вставкой. Клонированная в геномном векторе ДНК не отличается от остальной геномной ДНК в отношении её способности участвовать в процессах рекомбинации. Это позволяет проводить с ней различные манипуляции: вставки, делеции, замещения и добавление примыкающих сегментов. Кроме того, одним из преимуществ является возможность хранения клонированной ДНК при комнатной температуре в спорах B. subtilis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему моменту для B. subtilis разработано большое количество как непосредственно клонирующих векторов, так и специализированных векторов: для клонирования промоторов и терминаторов, для экспрессии, получения гибридных белков, векторов с регулируемой копийностью и векторов для осуществления направленной инактивации генов.

В основе векторов для B. subtilis лежат плазмидные реликоны, выделенные из близкородственных организмов, таких как Bacillus thuringiensis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus либо Lactococcus lactis.

Большинство из указанных векторов могут быть также использованы для ряда других грамположительных бактерий, т.к. репликоны, на основе которых они построены, часто могут обеспечивать репликацию и поддержание векторов в клетках бактерий принадлежащих к нескольким близким видам и даже родам.