Векторы для получения гибридных белков
Векторы pSG1192 (cfp) и pSG1193 (yfp) являются производные pSG1154 с изменённым полилинкером (как у pSG1186 и pSG1186) и дополнительным кодоном GTG сразу после старт-кодона гена флуоресцентного белка.
Данные векторы были использованы для двойного мечения спорулирующих клеток. Была прямо показана последовательная агрегация/дезагрегация белков участвующих в генерации клеточной асимметрии во время споруляции (белки FstZ и SpoIIE). Не смотря на сходность локализации во время споруляции, сигналы от FstZ-CFP и SpoIIE-YPF были чётко различимы друг от друга. В то же время было показано, что природный белок DsRed малопригоден для мечения клеток B. subtilis.
Для характеристики продукта исследуемого гена нужны антитела, с помощью которых можно осуществить обнаружение данного белка. Для получения антител необходимо очистить исследуемый белок и иммунизировать им животное. Эта процедура длительная и дорогая, а полученные антитела часто различаются по своим свойствам. Чтобы обойти эти проблемы был создан набор векторов для пришивания к белкам антигенных детерминант (реагирующая с антителом часть антигена) (Kaltwasser et al., 2002): FLAG (искусственно синтезированный пептид), HA (получен из гемагглютинина вируса гриппа) и c-Myc (получен из протоонкогена c-myc человека) длиной 8, 9 и 10 аминокислотных остатков соответственно. Антитела, специфически распознающие эти антигенные детерминанты, имеются в продаже.
 |
Рис.12. Векторы для получения гибридных белков. (a) Векторы для получения белков сшитых с антигенными детерминантами. (b) Векторы для получения белков слитых с флюоресцирующими белками. ori - репликативный регион плазмиды ColE1; EmR и ApR, гены резистентности к эритромицину и ампициллину, соответственно; lacI - ген репрессора LacI; Pspac - IPTG-зависимый промотор; t1t2t0, терминаторы(lt0; t1, t2 из rrnB), trpAt, терминатор триптофанового оперона E.coli; MCS, полилинкер; tag, последовательность, кодирующая антигенную детерминанту(FLAG, cMyc или HA); FP, ген флуоресцентного белка (GFP+, CFP или YFP).
На основе вектора pMUTIN2 (Vagner et al., 1998; см. выше) был сконструирован вектор pMUTIN-Ter (рис.12а). На его основе, путём вставки последовательностей, кодирующих соответствующие антигенные детерминанты, были получены векторы pMUTIN-FLAG, -cMyc и -HA. Для проведения слияния интересующего белка с этими антигенными детерминантами, 3¢-конец гена (около 300п.н.) вставляется непосредственно перед последовательностью, кодирующей антигенную детерминанту. Нужный гибридный белок будет синтезироваться после интеграции целого вектора в хромосомальный ген путём гомологичной рекомбинации. Если ген является частью оперона, то транскрипция проксимальнее расположенных генов оперона обеспечивается IPTG-зависимым промотором. Антигенные детерминанты c-Myc и HA могут быть также использованы для очистки гибридных белков путём аффинной хроматографии.
Аналогично на основе pMUTIN-Ter путём вставки последовательностей, кодирующих соответствующие флуорисцирующие белки, были получены векторы pMUTIN-GFP+, -CFP и –YFP (рис.12b), позволяющие производить слияние белков, кодируемых хромосомальными генами, с флуоресцирующими белками. Это позволяет проследить локализацию исследуемого белка в клетке. Функционирование всех шести векторов было протестировано на цитоплазматическом белке HtpG (белок теплового шока) и интегральном мембранном белке FtsH (протеаза).