Векторы для получения гибридных белков

B. subtilis долгое время изучается как образец простой клеточной дифференцировки т.к. при голодании у неё запускается программа дифференциальной экспрессии генов называемая споруляцией. Изучение споруляции в свою очередь привели исследованию процессов происходящих в течение клеточного цикла, в частности клеточного деления, сегрегации хромосом и синтеза макромолекул. В проведении этих исследований важную роль играет использование зелёного флуоресцирующего белка GFP (green fluorescent protein), применяемого в качестве цитологического маркера.

Слияние кодирующего его гена gfp с другими генами позволяет получать гибридные белки, локализацию которых можно проследить в живых клетках. Для этой цели было разработано ряд векторов (Lewis P.J, Marston, 1999; Feucht A., Lewis, 2001; Kaltwasser et al.,2002).

Была сконструирована серия векторов, несущих разные варианты гена gfp: gfpmutI (pSG1151, pSG1164, pSG1154, pSG1729) и gfpuv (pSG1156, pSG1170) (Lewis P.J, Marston, 1999; рис.11a, описание ниже). Продукты данных генов (GFPmut1 и GFPuv) представляют собой мутантные белки, обладающие по сравнению c природным GFP большей яркостью и различающиеся по спектру излучения. Последнее свойство позволяет параллельно проследить локализацию в одной клетке молекул двух типов белков сшитых с разными формами GFP (т.е. проводить двойное мечение клеток).

Векторы pSG1151 и pSG1156 (рис.11a). При использовании этих векторов участок гена, кодирующий С-концевой фрагмент исследуемого белка, вставляется перед gfp. В результате интеграции в хромосому путём одиночного кроссинговера происходит слияние gfp с нужным геном и гибридный белок экспрессируется с промотора данного гена. Проксимальнее вставленного вектора будет находиться неполная копия данного гена. При клонировании целого гена с его промотором в вектор, экспрессироваться будет как гибридный белок, так и белок дикого типа. Это необходимо если исследуемый белок является необходимым для клетки, а гибридный белок не полностью функционален.

Векторы pSG1164 и pSG1170 сходны с описанными выше. Однако они несут индуцируемые промоторы: ксилоз-зависимый Pxyl (pSG1164) и IPTG-зависимый Pspac (pSG1170). Это позволяет контролировать экспрессию дистальнее расположенных хромосомальных генов, если вставка произошла внутрь оперона.

Векторы pSG1154 и pSG1729 созданы для интеграции слитых генов в сайты amyE хромосомы B. subtilis путём двойного кроссинговера. Нужный ген сшивается с последовательностью гена gfp кодирующей N-конец (pSG1154) или C-конец GFP (pSG1729). В обоих случаях для получения функционального гибридного белка необходимо клонировать всю кодирующую последовательность гена. Экспрессия гибридного белка находится под контролем ксилоз-индуцируемого промотора Pxyl.