Векторы для направленной инактивации генов

Созданы векторы для проведения инсерционного мутагенеза в штаммах вида Bacillus cereus, основанного на встраивании мобильного элемента IS231A в случайные сайты хромосомы бактерии (Leonard et al.,1998). Созданные векторы pGIC055 и pGIC057 представляют собой версии одной плазмиды и построены на основе термочувствительного репликона pHT1030. В своём составе они имеют:

1) mini-IS231A, включающий в себя селективный маркер (устойчивость к канамицину [pGIC057] или спектиномицину [pGIC055]) и полилинкеры между инвертированными повторами;

2) ген транспозазы IS231A (TnA), находящийся под контролем сильного промотора Pdeg;

3) дополнительный маркер- ген устойчивости к эритромицину.

Транспозицию mini-IS231A из плазмид pGIC055 или pGIC057 в хромосому осуществляли при температуре 28°С. Плазмиды затем элиминировали путём повышения температуры культивирования до 46°С. Выяснилось, что в хромосоме Bacillus cereus имеется один сайт сильно предпочтительный для транспозиции mini-IS231A (левый инвертированный повтор транспозона Tn4430). Если в данный сайт уже осуществлена вставка, последующие вставки осуществляются в случайные сайты.

Путём повторной вставки были получены ряд ауксотрофных мутантов. С использованием рестрикционного анализа данные мутации (также как и предпочтительный для транспозиции сайт) были локализованы на карте хромосомы B. cereus.

Рис. 10. Структура векторов pGIC055 и pGIC057. ori - репликативный регион pHT1030; TnpA - ген транспозазы; MCS 2 - полилинкеры; Pdeg - сильный промотор; инвертированные повторы обозначены черными треугольниками; детерминанты устойчивости: EmR - к эритромицину, mini-IS - к спектиномицину (pGIC055) или канамицину (pGIC057).

Из мутанта ауксотрофного по аденину была вырезана вставка mini-IS231A вместе с прилегающими участками путём рестрикции EcoRI (в mini-IS сайт для данной рестриктазы отсутствует). Путём секвенирования и сравнения с последовательностями из баз данных было выявлено, что сайт, в который была осуществлена вставка, имеет высокую степень гомологии с генами pur оперона B. subtilis, что может указывать на то, что вставка mini-IS231A произошла в один из генов синтеза пуринов. Данные результаты показывают, что рестрикционный анализ вместе с секвенированием позволяют создавать объединённые физические и генетические карты бактериальной хромосомы B. cereus.

Данную систему можно использовать для проведения инсерционного мутагенеза также в других грамположительных бактериях, способных расти при температуре выше 45°.

В геноме B. cereus (как и в большинстве других про- и эукариотических геномов) отсутствует сайт рестрикции I-SceI. Данный сайт присутствует в полилинкере mini-IS. Поэтому последовательное введение двух mini-IS, несущих два разных маркера резистентности, в хромосому приводит к получению фрагмента ограниченного двумя сайтами I-SceI. Таким образом, путём рестрикции I-SceI можно получать фрагменты, подходящие для секвенирования. Данный метод позволяет избежать ряда трудностей встречающихся при использовании традиционных методик клонирования.