Векторы для направленной инактивации генов

Функции не охарактеризованных генов можно изучить путём их инактивации и последующего наблюдения эффекта инактивации при различных условиях роста клетки. Для проведения инактивации генов в B. subtilis создан набор векторов для осуществления инсерционного мутагенеза в хромосоме бактерии (Vagner et al.,1998). Данные векторы, обозначенные как pMUTIN, построены на основе репликона ColE1 (рис.8), поэтому они не способны реплицироваться в конечном хозяине (B. subtilis), что необходимо для проведения инсерционного мутагенеза. Они содержат ген-репортёр lacZ для измерения активности промотора исследуемого гена. Также в векторах присутствует индуцибельный промотор Pspac, необходимый для контроля экспрессии генов, находящихся в одном опероне с исследуемым геном и расположенным дистальнее от него. Данный промотор необходим из-за возможного полярного эффекта вставки. Промотор Pspac был модифицирован для лучшего контроля его активности. Он репрессируется репрессором LacI (кодируется геном lacI, присутствующим в векторе) и, следовательно, может быть индуцирован IPTG, инактивирующим LacI.

Рис. 8. Структура векторов pMUTIN. Общие черты векторов pMUTIN показаны на рисунке. Различия между векторами pMUTIN указаны в таблице справа от рисунка. Белые боксы являются генами экспрессируемыми в B. subtilis, чёрные боксы - гены экспрессируемые в E. coli. ori - область репликации ColE1. ApR и EmR, гены резистентности к ампициллину и эритромицину соответственно. lacZ, модифицированный ген b-галактозидазы - ген lacZ c RBS гена spoVG B. subtilis и стоп кодонами в трёх возможных рамках считывания; Pspac, индуцируемый промотор, содержащий последовательности распознавания РНК-полимеразой фага SPO1 и один из lac операторов - O1 или оператор oid; lacI, ген репрессора LacI модифицированный для конститутивной экспрессии в B. subtilis; Ter - терминаторы: lt0 присутствует во всех векторах ; t1t2 (сильные терминаторы из rrnB) в pMUTIN2 и pMUTIN4. Op - оператор LacI между промоторными последовательностями Pspac: O1 оператор присутствует в pMUTIN1 и pMUTIN2; оператор oid присутствует в pMUTIN3 и pMUTIN4. Различия между векторами pMUTIN указаны в таблице справа от рисунка.

Исследуемый ген можно инактивировать в результате одиночного кроссинговера между вставкой, осуществленной в вектор pMUTIN и геном, локализованным на бактериальной хромосоме (рис.9). Для этого внутренний фрагмент изучаемого гена амплифицируется с помощью ПЦР, клонируется в полилинкер pMUTIN, и получившаяся конструкцию используется для трансформации клеток B. subtilis. В результате интеграции ген прерывается и происходит транскрипционное слияние между его промотором и lacZ геном-репортёром. Если данный ген является частью оперона, то остальные дистально расположенные гены оказываются под контролем промотора Pspac. При этом терминатор l, расположенный перед Pspac предотвращает транскрибирование этих генов с других проксимально расположенных промоторов. Данные манипуляции приводят к образованию сразу двух типов мутантов: нулевых мутантов (по orf2) в результате разрыва гена и условных мутантов (по orf3) зависимых от IPTG.

Рис. 9. Интеграция pMUTIN в исследуемый ген. Гены оперона orf1-orf3 показаны в виде белых боксов. Заштрихованный ген соответствует внутреннему сегменту исследуемого гена. Вектор интегрируется в orf2 путём одиночного кроссинговера. Стрелки обозначают направление транскрипции, изломанные стрелки обозначают промотор оперона и Pspac.