Векторы экспрессии

В простейшем случае для экспрессии достаточно клонировать нужный ген вместе с его промотором и сайтом связывания с рибосомой (ribosome binding site, RBS) в природную плазмиду, способную реплицироваться в хозяине, в котором нужно проэкспрессировать данный ген. Так, например, в B. subtilis был проэкспрессировать ген термостабильной арабиназы термофильной бактерии Bacillus thermodenitrificans. Для этого фрагмент, содержащий данный ген (с предполагаемым промотором и RBS) был клонирован в природную плазмиду pUB110 (Takao et al., 2002).

Иногда удобно экспрессировать ген с не своего промотора, что позволяет вести экспрессию на более высоком уровне, или контролировать её. Так, ген термоактивной пуллуланазы гипертермофильной анаэробной архебактерии Desulfurococcus

mucosus (apuA) был успешно экспрессирован в B. subtilis (Duffner et al., 2000). Экспрессия гена шла под контролем промотора PamyM (рис. 2).

Рис. 2. Структура вектора pJA803 для клонирования пуллуланазы. RepB - область репликации pUB110; Cm - ген устойчивости к хлорамфениколу; apuA - ген пуллуланазы; PamyM - промотор гена мальтогенной a-амилазы из B. stearothermophilus.

В обоих вышеописанных случаях наблюдался относительно невысокий уровень экспрессии, однако, белки секретировались в среду в количестве, позволяющем их выделение в чистом виде и дальнейшее изучение свойств.

В случае, когда необходимо регулировать уровень экспрессии или экспрессировать белок в очень больших количествах, используют более сложные системы экспрессии.

B. subtilis является очень удобным организмом для проведения в нём экспрессии различных продуктов, т.к. эта бактерия обладает целым рядом полезных свойств: непатогенность, наличие механизмов секреции, хорошо изученные генетика и условия необходимые для экспрессии генов, простота манипуляций с использованием стандартных протоколов. Для повышения уровня продукции гетерологичных белков в клетках B. subtilis используют штаммы, дефектные по протеазам. Кроме того, можно применить более эффективные регуляторные элементы транскрипции и трансляции. Так, например, была создана кассета Veg

(Lam et al., 1998) содержащая сильные регуляторные элементы, подходящие для эффективной экспрессии и секреции гетерологичного белка. В состав кассеты вошли: промотор B. subtilis veg I; lac оператор E. coli; сайт связывания с рибосомой (RBS) B. subtilis; лидерная последовательность стафилококкового белка А (SPA); терминатор транскрипции глюконатового оперона B. subtilis (gnt); полилинкер (multiple cloning site, MCS), содержащий сайты рестрикции Xba I, Sma I; стоп кодоны для всех рамок считывания; фланкирующие EcoR I и Kpn I сайты (рис.3).

Рис. 3. Схематичное изображение регуляторных элементов в кассете Veg.

Длина кассеты 356 п.н. RBS - сайт связывания рибосомы; SPA - стафилококковый белок А; MCS - полилинкер. Подробности в тексте.

Кассета Veg была вставлена в полилинкер челночного вектора pM2 (рис. 4) с образованием pM2Veg – вектора для экспрессии и секреции белка в B. subtilis.

Для проверки эффективности функционирования вектора pM2Veg , в качестве гена-репортёра применили ген эндоглюконазы (ген cenA из Cellulomonas fimi). Была осуществлена вставка данного гена в сайт XbaI вектора pM2Veg. С помощью данной системы была достигнута продукция эндоглюконазы на уровне более чем в четыре раза превышающем самый высокий из уровней продукции достигнутых с помощью других систем экспрессии. Экспрессия и секреция белка оставалась на стабильном уровне, и не оказывала ни каких неблагоприятных эффектов на стабильность вектора и жизнеспособность клеток.

Рис. 4. Схематичное изображение векторов pM2 и pM2Veg.

ori pMB1 и ori pUB110 - репликационные регионы плазмид pMB1 и pUB110, соответственно; ,, - гены устойчивости к ампициллину, блеомицину и неомицину, соответственно.

С помощью pM2Veg в B. subtilis также экспрессирован ген hEGF – ген фактора роста эпидермиса человека. Регистрируемый уровень hEGF был вполне сопоставим с уровнем экспрессии данного гена при использовании других систем. Эти данные указывают на то, что вектор pM2Veg может успешно использоваться для экспрессии в B. subtilis разнообразных гетерологичных белков.