Метод определения наиболее вероятного числа бактерий (метод предельных разведений).

Этот способ позволяет провести грубый подсчет числа жизнеспособных клеток. Он состоит в том, что приготавливают несколько последовательных разведений культуры в ростовой среде и после инкубации подсчитывают число пробирок, в которых отсутствует рост. Предполагается, что в эти пробирки при посеве не было внесено ни одной жизнеспособной клетки. Принимая, что распределение клеток описывается формулой Пуассона, среднее число клеток т в данном разведении вычисляют по формуле

т = -1пР0, (6.11)

где ро — отношение количества пробирок, в которых отсутствует рост, к общему числу пробирок в данном разведении. Затем среднее значение умножают на фактор разбавления и корректируют с учетом объема инокулята, чтобы вычислить число жизнеспособных клеток в исходной культуре. Этот метод более трудоемок по сравнению с методами прямого подсчета, но его приходится использовать, если микроорганизм не растет на плотных средах. Кроме того, он позволяет учесть организмы, растущие медленнее других, если они находятся в одной пробе с быстрорастущими формами. Наиболее важное преимущество этого метода состоит в том, что в тех образцах, где, помимо исследуемых, присутствуют иные организмы, он позволяет выявить интересующий объект, например с помощью микроскопии или по образованию характерных продуктов (например, сероводорода бактериями сульфатредукторами; в присутствии Н2S и Fе(П) образуется черный осадок FеS). Кроме того, можно исключить контаминирующие бактерии, применяя селективные среды.

Прямой подсчет.

Количество микробных клеток можно подсчитывать непосредственно под микроскопом с помощью счетной камеры, представляющей собой специальное предметное стекло с небольшой выемкой известной глубины (обычно 0,02 мм) и нанесенной сеткой из небольших квадратов известной площади. Выемку заполняют исследуемой суспензией бактерий, и плотно закрывают камеру притертым прочным покровным стеклом, после чего подсчитывают количество бактерий в этом определенном объеме суспензии. Для прямого подсчета под микроскопом можно использовать также мембранные фильтры, окрашивая осажденные на них бактерии. При этом на высушенные фильтры наносят иммерсионное масло, благодаря чему они становятся прозрачными. Этот метод полезен для тех случаев, корда образец содержит менее 106 клеток/мл. Другим способом концентрирования проб может быть центрифугирование. Для подсчета бактериальных клеток весьма удобен электронный счетчик частиц (счетчик Коултера), позволяющий определять, помимо числа клеток распределение их по размерам.

В природных условиях измерять рост бактерий довольно сложно. Обычно для этого используют косвенные методы, такие как определение фиксации 14СО2 или [3Н]-тимидина. Кроме того, проводят прямой подсчет числа клеток с использованием флуоресцентного микроскопа, окрашивая клетки флуоресцентными красителями (например, 4',6-диамидино-2-фенилиндолом, ДАФИ) или обрабатывая их флуоресцентными ДНК-зондами.

4

Методы

хранения

культур

обеспечивают

длительное

поддержание

их

жизнеспособности

Основные цели хранения культур — это поддержание жизнеспособности клеток и чистоты культуры, а также предотвращение изменений и мутаций, т. е. сохранение микроорганизма в максимально близком к исходному штамму состоянии. Для хранения важен правильный выбор среды и метода культивирования, а также возраста культуры на момент начала хранения.

Методы непродолжительного хранения лишь частично удовлетворяют этим критериям. Из таких методов чаще всего применяется периодический пересев культур на свежую среду с выращиванием при низкой температуре и последующим хранением в холодильнике. Культуры споровых бактерий, содержащие зрелые споры, можно хранить сухими в стерильной почве, на стерильной фильтровальной бумаге или в виде культур, высушенных при помощи силикагеля. Некоторые бактерии хорошо переносят хранение в высушенных каплях желатина. Для многих целей хранят клетки в жизнеспособном состоянии в течение лет при температуре —20 °С или, что лучше, при —70 °С (глубокое замораживание). Для хранения с помощью этих методов необходимо использовать культуры в середине или в конце экспоненциальной фазы роста, сконцентрированные и затем ресуспендированные в небольшом количестве свежей питательной среды. При замораживании в среде должны присутствовать криопротекторы, такие как глицерол (15-40 об. %) или диметилсульфоксид (ДМСО, 5-10 об. %), предохраняющие клетки от повреждения замораживанием, которое должно происходить со скоростью 1 °С/мин. Оттаивание замороженных культур рекомендуется производить в более быстром режиме.

В настоящее время широко применяются методы длительного хранения, основанные на лиофилизации или ультразамораживании культур в жидком азоте (—196 °С) либо над жидким азотом (—150 °С). Для оценки эффективности этих методов их сравнивают по доле выживших клеток после определенного времени хранения. Ожидаемый период выживания бактерий при обоих способах длительного хранения превышает 40 лет, в то время как при глубоком замораживании он составляет 1-3 года. При ультра-замораживании к суспензии обычно добавляют криопротекторы, такие как глицерол (10 об. %) или ДМСО (5 об. %). Эти соединения водорастворимы и способны легко проходить через клеточную мембрану, имеют низкую точку плавления и могут замещать воду в качестве гидратной оболочки, уменьшая таким образом повреждающее влияние дегидратации при замерзании воды. Поэтому замораживание и образование кристаллов льда в среде протекает замедленно. Происходящее при этом возрастание концентрации внеклеточного раствора приводит к тому, что вода начинает выходить из клеток. По мере замораживания вся свободная вода кристаллизуется (в виде чистого льда), оставляя концентрированный раствор, замерзание которого приводит к образованию лишь незначительного количества повреждающих клетку кристаллов.