Разрешающая способность и погрешности метода, ошибки метода.

Под разрешающей способностью понимают степень точности с которой можно определить локализацию в препарате радиоактивного вещества («метки»). Разрешающая способность метода в данном случае ограничена двумя факторами.

Геометрическая ошибка – в связи с тем, что испускаемая частица может быть направлена под любым углом к поверхности фотослоя. Следовательно, зерно серебра в фотослое может быть расположено не точно над радиоактивным атомом, а более или менее смещено в зависимости от направления движения частицы и длины пробега (энергии).

Фотоошибка возникает в связи с тем, что зерно серебра, состоящее из тысяч атомов металла намного больше, чем радиоактивный атом. Таким образом, о локализации меньшего объекта приходится судить исходя из положения большего.

При использовании трития, характеризующегося малой энергией (пробегом) испускаемых частиц и ядерных фотоэмульсий с низкой зернистостью разрешающая способность метода радиоавтографии лежит в пределах разрешающей способности оптических систем – 1 мкм. Таким образом, эти ошибки не имеют существенного влияния на получаемый результат.

Для достижения лучшего разрешения необходимо уменьшать толщину среза, слоя эмульсии и расстояние между ними. Препарат следует немного недоэкспонировать.

Эффект автоабсорбции: Число зерен серебра зависит от степени поглощения излучения клеточными структурами, благодаря малому пробегу и малой энергии бета-частиц, их абсорбция в тканях достаточно велика, что может приводить к потере метки, поэтому важное значение приобретает вопрос о толщине срезов. Показано, что число зерен серебра пропорционально радиоактивности ткани только при толщине среза не более 5 мк.

Относительное число бета-частиц, прошедших сквозь слой поглотителя толщиной х может быть оценено по закону Бэра –

Nx/N0 = e -m x

Где m - коэффициент поглощения (величина, обратная толщине слоя, при прохождении которого число частиц уменьшается в e раз. Величину коэффициента поглощения можно приближенно оценить по величине Rm (максимальный пробег), известной для всех изотопов, с помощью соотношения m Rm = 10, справедливого для не слишком жестких излучений.

Если в слое единичной толщины в единицу времени возникает n частиц, движущихся к поверхности, то в образце толщиной х поверхности достигнет N частиц:

N =

Фон и артефакты: Ошибку в измерения могут вносить так же механические воздействия – царапины, трещины эмульсии, ведущие к образованию скрытого изображения и фоновое излучение, которое необходимо учитывать при обработке радиоавтографов. Фон учитывают подсчетом числа зерен серебра на пустом участке препарата. Ошибки так же вносятся в результате гистологической обработки срезов – проводки по спиртам (дегидратации), заключения в парафин, окраски. Эти процедуры могут влиять на размеры и соотношения клеточных структур.

Радиационный эффект меченых метаболитов: Благодаря малой энергии излучения тритий вызывает в клетке значительную ионизацию, намного превышающую радиационный эффект бета-частиц углерода. Вследствие этого при продолжительном действии меченого соединения например 3H-тимидина происходит разрушение и гибель клеток, приводящие к остановке роста тканей. В первую очередь нарушается сперматогенез. Имеются данные о мутагенном и канцерогенном действии меченых метаболитов. Наблюдаемые цитологические изменения заключаются в нарушении прохождения клетками митотического цикла, изменении плоидности клеток и появлении хромосомных аберраций. Но, по-видимому, повреждающее действие изотопа на клетки мождет заметным образом сказываться на результатах исследования лишь в условиях длительного эксперимента.