Биохимия азотфиксации.
Микроорганизмы, усваивающие молекулярный азот, называются диазотрофами. Основным элементом симбиоза является нитрогеназа – многомерный фермент, состоящий из комплекса двух белков: MoFe-белка и Fe-белка. Нитрогеназы из разных азотфиксаторов несколько различаются своими молекулярными массами и содержанием металлов. Каждый из белков, в свою очередь, состоит из нескольких субъединиц. Молекулярная масса MoFe-белка различных нитрогеназ находится в пределах 200-250 кДа. Фермент содержит по два атома молибдена, 28-34 атома железа и 18-24 атома серы на одну молекулу. Молекулярная масса Fe-белка колеблется от 50 до 70 кДа и также содержит атомы железа и серы. Нитрогеназа синтезируется в бактероидах и является катализатором фиксации азота:
N2 + 8[H] + 2
à 2 
+ H2
Этот процесс требует затраты энергии. По расчетам для клеток Rhizobium восстановление одной молекулы N2 требует затраты 25-35 молекул АТФ, то есть на каждый грамм фиксированного азота расходуется три-шесть грамм органического углерода. Кроме АТР нужны также восстановленные пиридиннуклеотиды и ферредоксины в качестве восстановительной силы.
Нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью, т.е. обладает способностью восстанавливать широкий спектр соединений, например, превращать ацетилен в этилен. Данная реакция применяется для определения нитрогеназной активности ацетиленовым методом. Ацетилен восстанавливается только до этилена, который легко поддаётся количественному определению с помощью газовой хроматографии.
Для активной работы нитрогеназы необходимы микроаэрофильные условия. Молекулярный кислород оказывает повреждающее действие на оба белка нитрогеназы, но более чувствителен к O2 Fe-белок. Чувствительность белков нитрогеназы к O2 определяется прежде всего чувствительностью их металлоцентров, которые участвуют как в связывании субстрата, так и в переносе электронов. Поскольку при этом может происходить и ступенчатое восстановление O2 по одноэлектронному механизму, в качестве продуктов такого восстановления возникают супероксидные ионы, перекись водорода и синглетный кислород, вносящие свой вклад в окислительное повреждение нитрогеназы. Нитрогеназные белки являются не единственным компонентом азотфиксирующей системы, чувствительным к O2. Ферредоксины и флаводоксины, донирующие электроны на нитрогеназу, могут автоокисляться и подвергаться необратимым окислительным повреждениям.
Микроаэрофильные условия в клубеньке обеспечиваются диффузным барьером (слой плотно прилегающих друг к другу клеток во внутреннем кортексе) и синтезом леггемоглобина (гемоглобинподобный белок, синтезируемый растительными клетками). Леггемоглобин связывает O2, транспортирует его к симбиосомам, обеспечивая дыхательную активность клубеньков. Он составляет 30 % белка в клубеньках и придает им ярко-розовый цвет. Нитрогеназный комплекс, образующий аммиак из воздуха, действует по очень экономно. Если в среде обитания достаточно ионов аммония или нитратов, он прекращает работу.
Потребление растениями аммиака, образовавшегося при азотфиксации или восстановлении нитратов почвы, осуществляется ферментами, связанными с биосинтезом так называемых первичных аминокислот, прежде всего глутаминовой, аспарагиновой кислот и их амидов. Одним из активно изучаемых ферментов является, например, глютаминсинтетаза. Этот фермент катализирует реакцию
глутаминовая кислота + NH3 + АТР à глутамин + ADP + Pi
Этот фермент встречается во всех организмах и принимает участие в присоединении аммиака к глутаминовой кислоте с образованием ее амида и последующим использованием его в различных реакциях синтеза азотсодержащих органических соединений. Близким по механизму действия является и аспарагинсинтетаза:
аспарагиновая кислота + + NH3 + АТР à аспарагин + ADP + Pi
Синтез аминокислот и амидов происходит с участием и других ферментов: глутаматдегидрогеназы, аспартазы и т.д. В конечном итоге азот в виде аминогрупп вовлекается в серию биосинтетических реакций организма, поддерживая его жизненные функции.