Векторы для клонирования промоторов
Наиболее удобные и универсальные системы созданные для изучения активности промоторов in vivo представляют собой плазмиду, несущую ген лишённый промотора, кодирующий продукты, легко поддающиеся количественному анализу (ген-репортёр). Фрагмент ДНК, чью промоторную активность необходимо проанализировать, можно вставить перед геном репортёром. По выходу продукта гена затем можно определить активность данного промотора. Для грамположительных бактерий сконструировано ряд плазмидных векторов для измерения активности промоторов, где в качестве гена-репортёра выступает ген b-галактозидазы или хлорамфеникол ацетилтрансферазы (без промоторов). Главным недостатком этих векторов является их высокая копийность, что мешает их использованию для точного измерения активности промотора in vivo. кроме того, они часто имеют узкий круг хозяев.
Создан мобилизуемый малокопийный челночный вектор pTCV-lac
(Poyart C., Tieu‑Cuot., 1997) с широким кругом хозяев.
Вектор сконструирован на основе двух репликонов - pACYC184 и pAMb1 (рис.6), что позволяет ему реплицироваться в клетках E. coli и в широком круге грамположительных бактерий (Bacillus, Enterococcus, Listeria, Streptococcus). Точка начала переноса плазмиды RK2 обеспечивает способность к переносу при конъюгации из клетки-донора E. coli в различные грамположительные бактерии. Роль гена-репортёра выполняет ген b‑галактозидазы (без промотора). Вектор присутствует в клетках в количестве 3-5 копий на хромосому; данная малокопийность позволяет точно измерять активность промоторов.
Рис. 6. Структура вектора pTCV-lac. oriR pACYC184 и oriR pAMb1 - rep-области плазмид pACYC184 и pAMb1, соответственно; ermB - ген устойчивости к эритромицину; aphA-3 - ген устойчивости к канамицину; lacZ безпромоторный ген, кодирующий b-галактозидазу, с сайтом связывания рибосомы для грамположительных бактерий (spoVG); oriT RK2, точка начала переноса плазмиды RK2.
Cконструированный вектор был использован для сравнения активности четырёх промоторов(Ptac, Ptrc, Pspac, PaphA-3) в двух грамположительных палочках (B. subtilis и Listeria monocytogenes) и двух грамположительных кокках (Enterococcus faecalis и Streptococcus agalactiae). Для этого осуществлялась вставка фрагментов EcoR I-BamH I в линеаризованный путём рестрикции рестриктазами EcoR I и BamH I вектор. Во всех данных хозяевах производные вектора оказались стабильными. Показано, что активность исследуемых промоторов, измеренная путём определения активности b-галактозидазы, сильно варьирует в зависимости от вида хозяина, в котором исследуется активность данного промотора. Эти данные показывают, что вектор pTCV-lac можно успешно использовать для анализа регуляции генов в широком круге грамположительных бактерий.