PacI

Рис. 5. a) Структура плазмиды pSWEET-bgaB. AmyE - сайты через которые идёт рекомбинация и интеграция с хромосомой; Cm и Amp - гены резистентности к хлорамфениколу и ампициллину, соответственно; ori - область репликации в E.coli; PacI, сайт рестрикции; b) ксилозная система экспрессии крупным планом. Показаны: ген ксилозного репрессора xylR; промоторы генов xylR (PxylR) и xylA (PxylA ) и оператор xylO; урезанный xylA (первые 58 п.н. + TAA), включающий в себя оптимизированный CRE; сайт связывания рибосомы гена tagD (RBS); ген bgaB, кодирующий термостабильную b-галактозидазу.

Данная система экспрессии (далее система xyl) была сравнена с широко применяемой системой экспрессии spac, основанной на применении лактозных репрессора и оператора E. coli для контроля экспрессии в B.subtilis. Для этого был использован вектор pSPAC-bgaB, созданный путём вставки bgaB в плазмиду pDR67(Weickert, Chambliss,

1990), содержащую spac систему для интеграции в сайт amyE. Для обеих систем экспрессии сайты связывания с рибосомой и окружающие генетические элементы были одинаковые. Опыты показали, что 1) для системы xyl характерна значительно более высокая разница между уровнем синтеза продукта при индукции и при репрессии (экспрессия при индукции в 279 раз выше, чем при репрессии; для spac системы – в 16 раз); 2) уровень экспрессии при индукции в 16 раз выше, чем у spac системы; 3) в отсутствие индуктора уровень экспрессии ниже, чем у spac системы; 4) система xyl проявляет чувствительность к большему диапазону концентраций индуктора.

Была протестирована способность системы xyl обеспечивать ксилоз-зависимую комплементацию. Была проведена попытка комплементировать термочувствительные мутанты (tag-12) по tagD гену, кодирующему фермент, участвующий в синтезе тейхоевых кислот (глицерол-3-фосфат цитидилтрансфераза). Ген tagD дикого типа был клонирован в pSWEET (с образованием pSWEET-tagD) для экспрессии под контролем системы экспрессии xyl. Мутанты с интегрированной в amyE с помощью pSWEET-tagD системой экспрессии и геном tagD под её контролем были способны к росту при непермессивной температуре в присутствии индуктора (ксилозы). Т.е. при росте при непермиссивной температуре происходила ксилоз-зависимая комплементация данного температур зависимого мутанта tag-12.

Таким образом было показано, что pSWEET является эффективной системой для точно регулируемой экспрессии клонированных генов в B. subtilis и, в частности новой эффективной системой экспрессии для условной комплементации в B. subtilis.