Клонирующие векторы

В штаммах B. subtilis содержится незначительное число естественных плазмид, причём большинство из них являются криптическими. Однако из других видов рода Bacillus, а также других родов грамположительных бактерий, было выделено множество плазмид, способных к автономной репликации в клетках B. subtilis. Первоначально плазмидные векторы для B. subtilis конструировались на основе мелких (размером меньше 10 kb) плазмид различных грамположительных бактерий, в первую очередь на основе плазмид, выделенных из Staphylococcus aureus (pC194, pE194, pUB110 и др.). Однако векторные молекулы, полученные на основе таких плазмид, проявляли высокую структурную нестабильность, и с их помощью можно было клонировать только короткие сегменты ДНК, а длинные сегменты часто подвергались перестройкам (Michel et al., 1980; Ehrlich et al., 1986).

Нестабильность мелких плазмид в клетках B. subtilis обусловлена механизмом их репликации. Указанные плазмиды реплицируются по типу катящегося кольца (RCR плазмиды), а вследствие разобщённости синтеза лидирующей и отстающей цепей, в процессе репликации образуется одноцепочечная ДНК, которая сильно стимулирует рекомбинацию между гомологичными последовательностями (Ehrlih et al, 1986). Одноцепочечный надрез, образуемый во время инициации репликации, также может быть причиной рекомбинации (Michel, Ehrlich, 1986; Baliester et al., 1989; Gros et al., 1989). Кроме того, вставки ДНК могут вызвать образование высокомолекулярных конкатемеров, увеличивая число копий плазмиды (Gruss, Ehrlich, 1989; Dabert et al., 1992), что может повысить частоту рекомбинации, а также поспособствовать отбору плазмид, утративших вставки.

Существует также другой тип плазмид, реплицирующихся в соответствии с механизмом тета-типа. При репликации по этому механизму не образуется интермедиатов в виде одноцепочечной ДНК, и по этой причине векторы, созданные на основе тета-репликонов гораздо стабильнее и, следовательно, эффективнее векторов на основе RCR плазмид. Первые данные об этом были получены в экспериментах по получению и изучению свойств клонирующих векторов pHV1431, pHV1432, pHV1435 и pHV1436 (Janniere et al., 1990).

Челночный вектор pHV1436 (рис. 1) был создан на основе репликона плазмиды pTB19. На основе репликона pAMb1 были сконструированы три клонирующих вектора: pHV1431, и полученные из него pHV1435 (путём инверсии rep-области pAMb1) и вектор pHV1432 (путём делеции небольшого фрагмента в последовательности rep-области pAMb1).

Рис. 1. Структура клонирующих векторов. ori pTB52 и ori pAMb1, репликационные регионы природных плазмид pTB19 и pAMb1 соответственно; pBR322, последовательность pBR322, включающая её репликационный регион; - ген устойчивости к хлорамфениколу.

Данные векторы оказались структурно намного более стабильными, чем векторы на основе сигма-репликонов (Janniere et al., 1990):

(1) при их использовании наблюдается гораздо более низкая частота рекомбинации между повторяющимися последовательностями (снижена в 1000 раз)

(2) с их помощью можно клонировать значительно более длинные сегменты ДНК; средний размер вставки 10 и 1 kb, с диапазоном 3 -17 kb и 0.1 - 1.7 kb для векторов на основе тета и сигма репликонов соответственно

(3) в отличие от RCR плазмид они способны к стабильному поддержанию больших сегментов ДНК

Данные свойства характерны и для других векторов, являющихся производными тета-плазмид. Кроме того, было показано, что в отличие от сигма-плазмид, тета-репликоны, со вставками или без них, не образуют или образуют незначительное число высокомолекулярных конкатемеров (Gruss, Ehrlich, 1988; Dabert et al., 1992a; Dabert et al., 1992b). Это также является одной из причин их структурной стабильности.

Помимо клонирующих векторов для Bacillus subtilis был создан ряд векторов специального назначения: векторы экспрессии, клонирования промоторов и терминаторов, векторы с регулируемой копийностью и т.д. При этом используются векторы на основе как сигма- так и тета-репликонов.