Работа микробиологов основана на методах элективного культивирования и получения чистых культур

До сих пор мы рассматривали методы выращивания и поддержания имеющихся культур бактерий. Однако для решения многих проблем научного и прикладного характера необходимы поиск в природе и выделение новых видов с ранее не описанными свойствами. При этом используют метод накопительных культур, введенный в практику более 100 лет назад С. Н. Виноградским и М. Бейеринком.

Принцип методов выделения.

В большинстве природных образцов в одном грамме материала присутствуют сотни различных видов бактерий, и тем не менее среди них можно не найти искомого. Чтобы выделить желаемый микроорганизм, важно иметь подходящий материал

из соответствующего местообитания. Например, экстремально термофильные бактерии с большой вероятностью можно выделить из воды горячих источников, анаэробные — из иловых отложений. В природе происходит естественное обогащение сред теми или иными микроорганизмами, если имеется постоянный приток специфического субстрата и относительно постоянные условия, По аналогии с этим метод накопительных культур основан на подборе селективной

(элективной) среды — благоприятной для искомого организма и неблагоприятной для других, а также селективных физико-химических условий культивирования. К сожалению, при использовании такого метода в накопительной культуре, как правило, доминируют быстрорастущие виды, которые подавляют все остальные формы. Медленнорастущие виды удается выделить только в том случае, если своевременно пересевать пробы из накопительной культуры на плотную среду в чашках Петри. Можно также высевать непосредственно

природные пробы на плотную элективную среду,

где медленнорастущие виды при длительной инкубации образуют видимые колонии.

Селективные условия

создают путем комбинирования различных источников энергии, углерода и других элементов (N, Р, S и т. д.) плюс доноров и акцепторов электронов, путем внесения в среду ингибиторов, варьирования освещенности, концентрации кислорода, температуры, рН, активности воды, солености и т. д., а также концентрации компонентов среды и спектрального состава света.

Чистые культуры,

или клоны, получаемые из одной клетки, выделяют в большинстве случаев с помощью методов, описанных в разд. 6.5 как способы измерения роста путем подсчета колоний. Простейший способ получения колоний — это посев проб из накопительной культуры на поверхность плотной питательной среды истощающим штрихом или в расплавленную и остуженную агаризованную

среду, разливаемую затем в чашки Петри либо пробирки. Среди выросших колоний выбирают полностью изолированные от других и тем же способом высевают их в виде суспензии на аналогичную среду. Если все колонии из второго пересева выглядят одинаково, их можно использовать далее для посева в жидкую среду (при этом также нужно брать изолированную колонию). Однако бактерии, способные к быстрому движению, в особенности спирохеты, могут легко распространяться по влажной поверхности среды и контаминировать чашку. Другой способ выделения — это последовательное разведение

клеточной суспензии питательной средой в соотношении 1 : 2 (или 1 : 10, 1 : 100; метод предельных разведений), с тем допущением, что последнее из разведений, где будет наблюдаться рост, исходно содержало лишь одну бактериальную клетку. Этот метод используют, если выделяемый организм количественно преобладает в накопительной культуре. В случаях, когда нельзя использовать ни высев на плотные среды, ни разведение пробы в жидкой среде, чистую культуру можно получить из отдельной бактериальной клетки, отобранной под микроскопом с помощью капиллярной пипетки и микроманипулятора. Все этапы выделения необходимо производить в нескольких повторностях и проверять чистоту выделенных колоний или культур по всем необходимым критериям.

Непрерывное культивирование служит ценным инструментом исследования

Рост в хемостате.

Скорость роста бактерий может изменяться в соответствии с условиями и составом среды, например в ответ на сдвиг в концентрации субстрата. Это свойство бактерий наглядно иллюстрирует хемостатная (непрерывная) культура. При непрерывном культивировании, в отличие от периодического, в культиватор постоянно подается свежая питательная среда и концентрация одного из субстратов поддерживается на уровне, лимитирующем рост. Одновременно происходит постоянный отток культуры, так что объем ее в культиваторе не изменяется. Культиватор снабжен мешалкой для равномерного распределения свежей среды.

Хемостатная культура обладает двумя неожиданными свойствами. Во-первых, при постоянном притоке свежей среды плотность клеток в ней сохраняется на постоянном уровне, и, во-вторых, стационарная концентрация клеток N остается практически неизменной даже при больших изменениях скорости протока (Е; размерность объем/ед. времени, например л/ч). Однако при скорости протока выше определенного значения стационарная концентрация клеток начинает резко падать, достигая нуля при критической скорости протока, соответствующей максимальной удельной скорости роста мах периодической культуры того же организма. Остаточная концентрация субстрата в культуре обычно очень низка, но возрастает гиперболически с увеличением скорости протока, пропорционально падению концентрации клеток.